Prodotti

Comprendere il metabolismo dell'ospite microbico è essenziale per lo sviluppo e l'ottimizzazione dei processi biocatalitici basati su cellule intere, poiché determina l'efficienza produttiva.Ciò è particolarmente vero per la biocatalisi redox in cui vengono impiegate cellule metabolicamente attive a causa della capacità rigenerativa del cofattore/cosubstrato endogena nell'ospite.L'Escherichia coli ricombinante è stato utilizzato per la sovrapproduzione di prolina-4-idrossilasi (P4H), una diossigenasi che catalizza l'idrossilazione della L-prolina libera in trans-4-idrossi-L-prolina con a-chetoglutarato (a-KG) come cosubstrato.In questo biocatalizzatore a cellula intera, il metabolismo centrale del carbonio fornisce il necessario cosubstrato a-KG, accoppiando le prestazioni biocatalitiche del P4H direttamente al metabolismo del carbonio e all'attività metabolica.Applicando strumenti di biologia sperimentale e computazionale, come l'ingegneria metabolica e l'analisi del flusso metabolico C (13) ((13) C-MFA), abbiamo studiato e descritto quantitativamente la risposta fisiologica, metabolica e bioenergetica del biocatalizzatore a cellula intera alla bioconversione mirata e identificato possibili colli di bottiglia metabolici per un'ulteriore ingegneria del percorso razionale. Un ceppo di E. coli carente di degradazione della prolina è stato costruito eliminando il gene putA che codifica per la prolina deidrogenasi.Le biotrasformazioni di cellule intere con questo ceppo mutante hanno portato non solo all'idrossilazione quantitativa della prolina, ma anche a un raddoppio della velocità di formazione specifica della trans-4-L-idrossiprolina (hyp), rispetto al tipo selvaggio.L'analisi del flusso di carbonio attraverso il metabolismo centrale del ceppo mutante ha rivelato che l'aumento della domanda di a-KG per l'attività P4H non ha migliorato il flusso di generazione di a-KG, indicando un'operazione del ciclo TCA strettamente regolata nelle condizioni studiate.Nel ceppo wild type, la sintesi e la catalisi di P4H hanno causato una riduzione della resa di biomassa.È interessante notare che il ceppo ΔputA ha inoltre compensato la perdita associata di ATP e NADH riducendo la richiesta di energia di mantenimento a tassi di assorbimento del glucosio relativamente bassi, invece di aumentare l'attività del TCA. essere promettente per la catalisi P4H produttiva non solo in termini di resa della biotrasformazione, ma anche per quanto riguarda i tassi di biotrasformazione e assorbimento della prolina e la resa di hyp sulla fonte di energia.I risultati indicano che, dopo un knockout putA, l'accoppiamento del ciclo TCA all'idrossilazione della prolina tramite il cosubstrato a-KG diventa un fattore chiave vincolante e un obiettivo per migliorare ulteriormente l'efficienza delle biotrasformazioni a-KG-dipendenti.