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Per quantificare in modo specifico diversi metaboliti del 5-fluorouracile (5-FU) e due nucleotidi monofosfati endogeni, abbiamo sviluppato un metodo originale basato su una cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).Questo saggio ha permesso di determinare: (i) la produzione intracellulare di 5-fluoro-2′-deossiuridina-5′-monofosfato (5-FdUMP) da 5-FU o 5-fluoro-2′-deossiuridina (5-FdUrd) , (ii) l'impatto della concentrazione di 5-FdUMP sul rapporto intracellulare 2′-deossiuridina-5′-monofosfato (dUMP)/timidina-5′-monofosfato (TMP) e (iii) l'entità della secrezione di 5-FdUMP e 5-FU da cellule umane in coltura mediante trasportatori ABC.Nelle nostre condizioni sperimentali, le cellule sono state incubate con 5-FU o 5-FUrd.Quindi, le proteine ​​cellulari sono state precipitate dal metanolo.Questa procedura ha fornito un elevato recupero dell'estrazione.Inoltre, per misurare la secrezione di 5-FU e 5-FdUMP dalle cellule, abbiamo effettuato la quantificazione di queste molecole nel mezzo di coltura.I terreni sono stati iniettati direttamente (5-FU) o sono stati sottoposti a un'estrazione in fase solida utilizzando la cartuccia di estrazione Oasis Wax (5-FdUMP).La separazione degli analiti è stata eseguita su una colonna dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm × 2,1 mm id) con modalità isocratica utilizzando tampone formiato di ammonio/metanolo/acqua (5/5/90, v/v) come fase mobile.Il tempo di esecuzione non ha superato i 6,2 min.Gli analiti sono stati ionizzati in un'interfaccia elettrospray in modalità ioni negativi.Abbiamo convalidato il metodo su un intervallo di 2,5–150 ng mL −1 in base ai composti.La variabilità intra e inter-dosaggio era inferiore al 10% nell'arco di sette giorni.Tutti i composti erano stabili nelle cellule o nel terreno di coltura quando i campioni venivano conservati a -20 °C per almeno due settimane e dopo tre cicli di congelamento-scongelamento.Nessun effetto matrice è stato osservato in entrambi i media.