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Nuovo test di cromatografia liquida ad alte prestazioni per glicosiltransferasi basato sulla derivatizzazione con acido antranilico e rilevamento della fluorescenza.

I saggi sono stati sviluppati utilizzando l'esclusiva chimica di etichettatura dell'acido 2-amminobenzoico (2AA; acido antranilico, AA) per misurare le attività sia della β1-4 galattosiltransferasi (GalT-1) che dell'α2-6 sialyltransferasi (ST-6) mediante liquido ad alte prestazioni cromatografia (HPLC) con rilevamento della fluorescenza (Anumula KR. 2006. Advances in fluorescence derivatization methods for high-performance liquid chromatographic analysis of glycoprotein carbs. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetilglucosamina (GlcNAc) e N-acetillattosamina sono state utilizzate come accettori e uridina difosfato (UDP)-galattosio e citidina monofosfato (CMP)-acido N-acetilneuraminico (NANA) come donatori rispettivamente per GalT-1 e ST-6.I prodotti enzimatici sono stati etichettati in situ con AA e sono stati separati dai substrati sulla colonna TSKgel Amide 80 utilizzando condizioni di fase normale.Le unità enzimatiche sono state determinate dalle aree di picco per confronto con gli standard derivatizzati in concomitanza Gal-β1-4GlcNAc e NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Sono state stabilite la linearità (tempo e concentrazione enzimatica), la precisione (intra- e interassay) e la riproducibilità delle analisi.I saggi si sono rivelati utili nel monitoraggio delle attività enzimatiche durante l'isolamento e la purificazione.I test erano altamente sensibili e eseguiti in modo uguale o migliore rispetto alle tradizionali misurazioni basate sullo zucchero radioattivo.Il formato del saggio può anche essere utilizzato per misurare l'attività di altre transferasi, a condizione che gli accettori di carboidrati contengano un'estremità riducente per l'etichettatura.È stato sviluppato un test per gli accettori di glicoproteina utilizzando IgG.È stato sviluppato un breve metodo di profilatura HPLC per la separazione dei glicani IgG (biantennari G0, G1, G2, mono e disialilati), che ha facilitato la determinazione delle attività GalT-1 e ST-6 in modo rapido.Inoltre, questo metodo di profilazione dovrebbe rivelarsi utile per monitorare i cambiamenti nei glicani IgG in ambito clinico.