Prodotti

L'analisi degli eventi di fosforilazione a livello di proteoma è ancora una grande sfida analitica a causa dell'enorme complessità delle reti di fosforilazione proteica.In questo lavoro, valutiamo la complementarità di Lys-N, Lys-C e tripsina per quanto riguarda la loro capacità di contribuire all'analisi globale del fosfoproteoma.Una versione raffinata dello scambio cationico forte a basso pH è stata utilizzata per separare in modo efficiente i peptidi N-terminalmente acetilati, fosforilati e non modificati.È stato possibile identificare un totale di 5036 fosfopeptidi non ridondanti con un tasso di falsa scoperta <1% da 1 mg di proteine ​​utilizzando una combinazione dei tre enzimi.I nostri dati hanno rivelato che la sovrapposizione tra i set di dati del fosfopeptide generati con diverse proteasi era marginale, mentre la sovrapposizione tra due set di dati triptici generati in modo simile è risultata almeno 4 volte superiore.In questo modo, l'uso parallelo di Lys-N e tripsina ha consentito un aumento del 72% del numero di fosfopeptidi rilevati rispetto alla sola tripsina, mentre un esperimento di replica della tripsina ha portato solo a un aumento del 25%.Pertanto, concentrandoci esclusivamente sui dati di tripsina e Lys-N, abbiamo identificato 4671 fosfopeptidi non ridondanti.Un'ulteriore analisi dei siti rilevati ha mostrato che i set di dati di Lys-N e tripsina sono stati arricchiti in motivi di fosforilazione significativamente diversi, evidenziando ulteriormente che gli approcci multiproteasi sono molto preziosi nelle analisi del fosfoproteoma.