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La fosforilazione delle proteine ​​regola diverse funzioni cellulari e svolge un ruolo chiave nello sviluppo precoce delle piante.Per integrare ed espandere le precedenti indagini sulla fosforilazione proteica nelle piantine di Arabidopsis, abbiamo utilizzato un approccio alternativo che combina l'estrazione proteica in condizioni non denaturanti con l'arricchimento IMAC (immobilizzato con cromatografia di affinità di ioni metallici) di fosfoproteine ​​intatte in estratti impoveriti di Rubisco, seguito dall'identificazione utilizzando l'elettroforesi su gel bidimensionale (2-DE) e la spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida (LC-MS/MS).La digestione della tripsina in gel e l'analisi di punti di gel selezionati hanno identificato 144 peptidi e residui fosforilati, di cui solo 18 fosfopeptidi e 8 fosfositi sono stati trovati nei database dei siti di fosforilazione di PhosPhAt 4.0 e P3DB Arabidopsis thaliana.Più della metà delle 82 fosfoproteine ​​identificate erano coinvolte nel metabolismo dei carboidrati, nella fotosintesi/respirazione o nei meccanismi di risposta allo stress ossidativo.L'arricchimento di fosfoproteine ​​intatte prima di 2-DE e LC-MS/MS sembra migliorare il rilevamento di residui di treonina e tirosina fosforilati rispetto ai metodi che utilizzano l'arricchimento a livello di peptide, suggerendo che i due approcci sono in qualche modo complementari in termini di copertura del sito di fosforilazione.Il confronto dei risultati per le giovani piantine con quelli ottenuti in precedenza per le foglie mature di Arabidopsis ha identificato cinque proteine ​​che sono differenzialmente fosforilate in questi tessuti, dimostrando il potenziale di questa tecnica per studiare la dinamica della fosforilazione proteica durante lo sviluppo della pianta.