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Il modo in cui gli effetti di mutazioni simultanee si combinano per modificare l'attività enzimatica non è facilmente prevedibile perché questi effetti non sono sempre additivi in ​​modo lineare.Pertanto, la caratterizzazione degli effetti di mutazioni simultanee dei residui amminoacidici che legano il substrato può dare un contributo significativo alla comprensione della specificità del substrato degli enzimi.Nella beta-glicosidasi di Spodoptera frugiperda (Sfbetagly), entrambi i residui Q39 ed E451 interagiscono con il substrato e questo è essenziale per definire la specificità del substrato.I doppi mutanti di Sfbetagly (A451E39, S451E39 e S451N39) sono stati preparati mediante mutagenesi sito-diretta, espressi nei batteri e purificati mediante cromatografia di affinità.Questi enzimi sono stati caratterizzati utilizzando p-nitrofenil beta-galattoside e p-nitrofenil beta-fucoside come substrati.Il rapporto k cat/Km per mutanti singoli e doppi di Sfbetagly contenente mutazioni sito-dirette nelle posizioni Q39 ed E451 è stato utilizzato per dimostrare che l'effetto sull'energia libera di ESdouble dagger (complesso dello stato di transizione enzimatica) delle doppie mutazioni (Gdouble daggerxy) non è la somma degli effetti risultanti dalle singole mutazioni (Gdouble daggerx e Gdouble daggery).Questa differenza in Gdouble dagger indica che gli effetti delle singole mutazioni si sovrappongono parzialmente.Quindi, questo effetto comune conta solo una volta in Gdoppio pugnalexy.I dati cristallografici sulle beta-glicosidasi rivelano la presenza di un legame idrogeno bidentato che coinvolge i residui Q39 ed E451 e lo stesso gruppo idrossilico del substrato.Pertanto, sia i dati termodinamici che quelli cristallografici suggeriscono che i residui Q39 ed E451 esercitano un'influenza reciproca sulle rispettive interazioni con il substrato.